三、淋巴细胞的分离和检测技术

　　(一)外周血单个核细胞的分离

　　聚糖-泛影葡胺(又称淋巴细胞分离液)密度梯度离心法是分离制备外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的常用方法。将抗凝血叠加于分离液上，通过低速离心，即可将不同比重的细胞分层：红细胞沉于管底;中性粒细胞密集布于红细胞层与分离液之间;血小板悬浮于血浆中;PBMC则密集于血浆层与分离液界面。PBMC含淋巴细胞和单核细胞。利用单核细胞粘附塑料的特性，可将其从PBMC中移去。

　　(二)流式细胞法

　　流式细胞法(flow cytometry，FCM)是用荧光活化细胞分类仪(fluorescence-actirated cell sorter，FACS)对细胞进行分类的方法。用荧光素标记的抗体识别和结合待分离的细胞。根据细胞标记荧光素的有无和种类，采用FACS可分离各种免疫细胞。采用流式细胞法，也可利用细胞的表面标志对各种免疫细胞进行鉴定。

　　(三)磁珠分离法

　　磁珠分离法是利用免疫磁珠进行分离细胞的方法。免疫磁珠(immune magnetic bead，IMB)是特异性抗体与磁性微粒的交联物。IMB可通过磁珠上的特异性抗体识别并结合表达相应膜抗原的细胞。应用磁场，可分离结合IMB的细胞。如采用抗CD3特异性抗体IMB可分离T淋巴细胞。

　　(四)T细胞的功能测定技术

　　1.T淋巴细胞转化试验 在体外培养的条件下，人T淋巴细胞受特异性抗原(如结核菌素)或非特异性有丝分裂原如植物血凝素(PHA)的刺激后可发生增生，转化为淋巴母细胞。以3H-胸腺嘧啶参入试验可测定淋巴细胞发生转化的程度。细胞免疫功能低下的人，T淋巴细胞转化率降低。刀豆蛋白A(ConA)是小鼠T细胞的非特异性有丝分裂原。

　　2.混合淋巴细胞培养器官移植前应取受体与供体的淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养试验以挑选合适的供体。混合淋巴细胞培养分双向法和单向法。

　　(1)双向法：将两个个体的淋巴细胞混合在一起培养，若二者的HLA分子不同，两个来源的淋巴细胞都会受到刺激而发生转化。根据转化的程度可判定两个个体淋巴细胞HLA分子的相异的程度。单卵双生子间的淋巴细胞混合培养后不发生转化。

　　(2)单向法：将一个个体的淋巴细胞用丝裂霉素或放射处理使之失去自身的转化能力，但保留着抗原性。用这种淋巴细胞和未经处理的另一个个体的淋巴细胞混合培养。根据未经处理的淋巴细胞的转化程度来判定两个个体淋巴细胞HLA分子的相差的程度。

　　混合淋巴细胞培养实验中，T淋巴细胞和B淋巴细胞均可发生转化。

　　3.迟发超敏反应皮试 将已知量的抗原(如结核菌纯化蛋白衍生物)注射入前臂皮内，24～48小时后测定硬结大小，硬结直径大于lOmm即被视为阳性。皮试阴性的人，可能有细胞免疫功能低下也可能未接触过相应的抗原。

　　4.细胞介导的细胞毒试验 用效应性CTL和51Cr标记的靶细胞相互作用。被杀伤的靶细胞可释放51Cr。测定靶细胞释放的51Cr产生的放射性，就可判定效应细胞效应性CTL的细胞毒活性。用类似的方法也可测定NK细胞的细胞毒活性。

　　(五)B淋巴细胞功能的检测

　　1.B淋巴细胞转化试验将人淋巴细胞和不溶性的金黄葡萄球菌(B淋巴细胞分裂原)一起培养，以3H-胸腺嘧啶参入试验可测定发生B淋巴细胞发生转化的程度。细菌脂多糖是小鼠的B细胞分裂原。

　　2.抗体生成细胞的测定 常用溶血空斑试验(hemolytic plaque assay)。在此实验中，抗体生成细胞分泌的Ig与绵羊红细胞(SRBC)表面的抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。方法是将吸附有已知抗原的SRBC、待检的B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾注平皿，温育l～3小时后，肉眼可见分散的溶血空斑，每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数。

　　四、细胞因子的检测技术

　　(一)生物活性检测

　　多种细胞因子(如IL-2、IL-6)在体外试验中可刺激其依赖株细胞增生。以3H-胸腺嘧啶核苷参入法做细胞增生试验就可判定这些细胞因子的生物学活性。

　　利用某些细胞因子的功能特点也可检测其生物学活性。例如，利用干扰素可保护L929细胞免受水泡性口炎病毒的破坏的性质可检测干扰素的生物学活性。利用TNF杀伤L929细胞的特点检测TNF的生物学活性。

　　(二) ELISA检测

　　采用ELISA法,用细胞因子的特异性抗体可对各种细胞因子进行定量测定。

　　(三)DNA聚合酶链反应

　　采用反转录(RT)DNA聚合酶链反应(PCR )的方法，即RT-PCR方法可测定待检细胞中细胞因子特异性mRNA 的表达。该法易出现假阳性和假阴性的结果.为了克服此缺点，在实验中必须设严格的对照。

　　例题：

　　1、外周免疫器官不包括( )

　　A、胸腺

　　B、淋巴结

　　C、脾脏

　　D、粘膜相关淋巴组织

　　2、人B细胞分化成熟的部位是在( )

　　A、胸腺

　　B、脾脏

　　C、骨髓

　　D、法氏囊

　　3、木瓜蛋白酶水解IgG所获片段中，能与抗原特异结合的是( )

　　A、Fab段

　　B、Fc段

　　C、F(ab)2 段

　　D、pFc段

　　参考答案

　　1、A 2、C 3、A